顯微高光譜成像係統在臨床醫學、生物學、材料學、微電子學等領域具有廣泛應用。很多用戶這種設備也比較好奇，本文簡單介紹了顯微高光譜成像係統的成像原理和結構設計。

顯微高光譜成像係統的成像原理

顯微高光譜成像實驗係統基於推帚式成像光譜儀的原理進行設計，光路原理圖如圖所示。

處於顯微鏡載物台上的樣品被柯勒照明係統照明，瞬時視場內的樣品條帶通過顯微鏡物鏡和0.6倍CMount接口鏡頭成像於分光計的狹縫處，再經過光譜分光組件後，在垂直樣品條帶方向按光譜色散，最後成像於CCD像麵。

CCD光敏麵平行於狹縫的一維稱為空間維，垂直於狹縫的一維稱為光譜維，空間維每一行光敏元上得到的是樣品條帶一個光譜波段的像，這樣麵陣CCD相機每幀圖像便對應於一個樣品條帶的多光譜圖像。通過載物台自動裝置對樣品進行推掃，就得到整個樣品的二維圖像及光譜數據，即圖像立方體。

整個係統由顯微鏡、分光計、麵陣CCD相機、載物台自動裝置以及數據采集與控製模塊等幾部分組成。係統的光譜範圍從400nm到800nm，120個波段，光譜分辨率優於5nm，空間分辨率大約1μm。不僅能夠提供微小物體在可見光範圍的單波段顯微圖像，而且能夠獲得圖像中任一像素的光譜曲線，實現了光譜技術和顯微成像技術的結合，在微觀領域有著廣泛的應用。

顯微高光譜成像係統的結構設計

1. 總體結構設計

由於顯微鏡是帶有光源的主動光學係統，因此，為了獲得成像光譜，從總體上考慮，有兩種係統結構可供選擇：

一種是在前光學係統進行光譜分光，即采用波長調諧的照明光源，照明光源以一定的波長間隔連續或非連續地掃描，在每一個預定的波長處得到一個灰度圖像，波長掃描後便構成光譜圖像立方體。這種方法的主要優點是不用在成像光路中插入任何光學和機械元件，因而不會增加額外的光學像差。缺點是很費時，對於上百個波段的高光譜成像而言，往往需要長達小時量級的時間。而且，這種方法不適用於熒光應用，因為要得到熒光需要激發光源。

另一種結構是在後光學係統（即成像光束）中進行光譜分光，這是用於航空航天遙感領域的光譜成像儀中廣泛采用的方法，對於顯微高光譜成像係統，這種方案也可以借鑒。

因此，本顯微高光譜成像實驗係統采用後一種結構形式，即在成像光束中進行光譜分光。利用推帚式光譜成像儀的原理進行設計，將光譜儀子係統光學耦合到生物顯微鏡的三目鏡筒上；利用高精度步進電機驅動載物台進行微米級平動，實現推帚成像。

整個係統在結構上主要由顯微鏡、分光計、CCD相機、數據采集和控製係統幾部分組成。

2. 分光子係統設計

目前，用於成像光譜儀器的光譜分光方法主要有棱鏡分光、光柵分光、傅裏葉變換、聲光可調諧濾光片、液晶可調諧濾光片、漸變濾光片、二元光學元件等方法。從目前的應用情況來看，光柵分光仍是應用廣泛而且技術相對成熟的光譜分光方法。因此，本係統仍采用傳統的光柵分光方法。而對於光柵而言，又可分為反射光柵和透射光柵。由於該係統屬於直視係統，即同軸光學係統，因此，若采用反射光柵，將使係統的光軸發生折轉，從而給係統結構設計帶來困難。為簡化設計，本係統采用透射光柵分光。

對於透射光柵，根據光柵方程，當垂直光柵入射，即入射角為零時，若取+1級或-1級衍射光譜，則衍射角不為零，即所有衍射光線將沿係統主光軸發生偏轉，從而造成整個係統為非同軸係統。因此，為了使整個係統保持為同軸光學係統，采用棱鏡-光-棱鏡組合的分光方式，使分光後中心波長的衍射光線沿係統主光軸衍射。光譜分光係統的主要設計參數如下：

狹縫：寬度25um，有效長度8.8mm；準直光學鏡頭：f=40mm，f/2.8；會聚光學鏡頭：f=40mm，f/2.8，與準直光學鏡頭為對稱式結構；光柵頻率：3151/mm；前棱鏡：頂角11.8?，上寬度2.4mm，下寬度5.8mm，中心厚度4.1mm；後棱鏡：頂角11.2?，上寬度1.0mm，下寬度5.5mm，中心厚度3.2mm。

3. 載物台自動裝置設計

根據推帚式成像光譜儀的特點，係統使用狹縫作為視場光闌，對瞬時視場內的

觀測目標進行一維采樣，因此，要獲得整個觀測目標的二維圖像，必須對另一維進行推帚。用於航空遙感的推帚式成像光譜儀是借助飛機的向前運動來完成推帚的，與之不同的是，顯微高光譜成像係統是利用載物台的平動來實現對樣品的推帚成像，因此該實驗係統需要設計和研製載物台自動裝置。為了獲得準確的光譜圖像，必須對載物台的運動速度進行精確的控製。本係統利用步進電機連接滾珠絲杠，將滾珠絲杠的移動橫梁連接到載物台，來驅動載物台運動。因此，載物台的運動速度是通過對步進電機的轉速控製來實現的。而步進電機的轉速控製是通過單片機產生方波脈衝信號來觸發步進電機進行步進旋轉。因此，單片機產生的方波脈衝信號頻率最終決定了載物台的運動速度。

係統的瞬時視場與係統的總放大倍數和CCD光譜維像元尺寸有關。在該係統中，CCD光譜維像元大小為27um，當使用40倍物鏡時，係統的總放大倍數為40?.6=24倍。因此，係統在光譜維方向的空間分辨率為27/24=1.125um，而相機的幀速率為30幀/秒，所以，載物台的運動速度為1.125?0=33.75um/s。由於絲杠的螺紋間距為1mm，即1000um，步進電機的每轉步數為10000步/轉，因此，步進電機每旋轉一步對應載物台的前進距離為1000/10000=0.1um，最後計算出電機的運行頻率為33.75/0.1=337.5Hz，即需要產生的方波脈衝的周期為2963μs。

4. 數據采集子係統

數據采集係統主要包括高光譜結果數據傳輸、采集、控製、存儲和實時顯示等功能，由於高光譜成像係統的數據傳輸速率非常高，因此傳統的基於ISA、EISA總線的數據采集係統已不能滿足要求。而PCI總線的最大數據傳輸速率為132

MB/s，能滿足高光譜成像係統數據采集的要求。所以，本係統采用PCI總線作為數據采集的微機接口。

數據采集係統采用模塊化設計方法，將各個主要功能模塊分離開來，模塊間采用統一的接口進行通信；並且在數字邏輯實現上，采用在係統可編程（In System Program）器件，通過軟件對係統進行配置，提高係統的靈活性。其具體設計方法與其他高光譜成像儀器的數據采集係統類似。